Obecný MLPA protokol pro detekci a kvantifikaci nukleových kyselin

MLPA kity používejte v souladu s jejich popisy a také následným protokolem, čili návodem, který jsme pro vás ve spolupráci se společností MRC-Holland připravili.

Některé produkty MLPA z MRC-Holland jsou registrovány pro diagnostiku in vitro (IVD) ale jen v určitých zemích. Ve všech ostatních případech jsou MLPA výrobky určeny pouze pro výzkumné účely (RUO). Informace o registraci IVD lze nalézt ve specifickém popisu produktu příslušného kitu. Alternativní "dvou-zkumavkový" protokol je k dispozici a je vhodný pro použití vzorků DNA s nízkou kvalitou (RUO).

Obsah

1. Použití

2. Princip testu MLPA

3. SALSA^® MLPA^® TEST- obsah kitů a podmínky skladování
3.1. Katalogová čísla kitů
3.2. Další složky dodávané s MLPA kitem
3.3. Skladování a stabilita
3.4. Materiál který není součástí kitu
3.5. Bezpečnostní opatření a upozornění
3.6. Limitace metody

4. Návod pro provedení testu
4.1. Příprava vzorků
4.2. Výběr referenčních a dalších kontrolních vzorků

5. MLPA reakce - DNA detekce / kvantifikaci
5.1. Poznámky – čtěte před provedením (1. den)
5.2. Program termocykleru pro MLPA reakci
5.3. Denaturace DNA (1. den) 
5.4. Hybridizace (1. den)
5.5. Ligace (2. den)
5.6. PCR reakce (2. den)

6. Separace fragmentů pomocí kapilární elektroforézy
6.1. Poznámky – čtěte před provedením
6.2. Specifikace elektroforézy

7. Kontrola MLPA a řešení problémů s kvalitou
7.1. Kontrola kvality MLPA fragmentů
7.2. Kontrola bez DNA
7.3. Problémy s odpařováním
7.4. Řešení problémů

8. Princip analýzy MLPA dat
8.1. COFFALYSER.NET pro analýzu MLPA dat
8.2. Zásady normalizace MLPA dat I: Od píků ke kvocientu dávky (DQ) 
8.3. Zásady normalizace MLPA dat II: Od kvocientu dávky k počtu kopií 

9. Interpretace výsledků

10. Stručný MLPA protokol

1. POUŽITÍ

Variabilita v počtu kopií (Copy Number Variace - CNV) je významným zdrojem genetické variability v lidské DNA a hraje roli u řady onemocnění. MLPA (Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification) je semi-kvantitativní metoda, která je používána pro stanovení relativního počtu kopií až 60 sekvencí DNA v jediné multiplexní PCR reakci. Firma MRC-Holland vyrábí a prodává reagencie pro MLPA a širokou škálu MLPA kitů. Společně tyto produkty mohou být použity k detekci delecí a duplikací ve vzorcích DNA. Podrobnosti o použití jsou uvedeny v popisu produktu pro specifický MLPA kit.

2. PRINCIP MLPA TESTU

Jak je uvedeno na Obrázku 1, princip MLPA testu je založen na amplifikaci (za použití jednoho páru primerů PCR) až 60 sond, z nichž každá detekuje specifickou DNA sekvenci o délce přibližně 60 nukleotidů. Po denaturaci DNA se přidá ke vzorku směs MLPA sond. Každá MLPA sonda se skládá ze dvou oligonukleotidů, které musí hybridizovat okamžitě k přilehlým cílovým sekvencím, aby mohly být spojeny do jedné sondy. Každá sonda v MLPA kitu má jedinečnou délku amplikonu, obvykle v rozmezí od 130 do 500 nt. V průběhu následné PCR reakce, všechny ligované sondy jsou amplifikovány současně pomocí stejného PCR páru primerů. Jeden PCR primer je fluorescenčně značený a umožňuje tak vizualizaci amplifikačních produktů během separace fragmentů.

Separace se provádí na přístroji kapilární elektroforézy, čímž se získá specifický elektroforeogramu (Obrázek 2A, vlevo). Relativní výška každého vrcholu (píku) jednotlivých sond ve srovnání s relativní výškou píků sond v různých referenčních vzorcích DNA odráží relativní počet kopií odpovídající cílové sekvence ve vzorku. Delece jedné nebo více cílových sekvencí vede k relativnímu snížení výšky píku (Obrázek 2B, vpravo), zatímco zvýšení relativní výšky píku odráží duplikaci.

3. SALSA® MLPA® TEST- OBSAH KITŮ A PODMÍNKY SKLADOVÁNÍ

3.1. KATALOGOVÁ ČÍSLA KITŮ

3.2. DALŠÍ SLOŽKY DODÁVANÉ S MLPA KITEM

Žádná ze složek kitu není odvozena od lidí, zvířat nebo patogenních bakterií. Žádná ze složek není přítomna v nebezpečných koncentracích, jak je definováno v Hazard Communication Standards. Bezpečnostní list není nutný pro tyto produkty: žádný z přípravků neobsahuje nebezpečné látky (podle směrnice 67/548 / EEC a změny) v koncentracích, které vyžadují distribuci bezpečnostního listu (podle směrnice 1999/45/EEC 2001/58/EEC).

3.3. SKLADOVÁNÍ A STABILITA

Všechny součásti kitu SALSA MLPA musí být uloženy hned po dodání mezi -25 °C a -15 °C, musí být chráněny před světlem a v původním obalu. Pokud se skladují za doporučených podmínek, je zaručena trvanlivost minimálně 1 rok, a to i po otevření. Viz popisky na každé lahvičce a přesné datum expirace každého roztoku. Ligazový pufr by neměl být vystaven více než 20 zmrazovacím cyklům.

3.4. MATERIÁL KTERÝ NENÍ SOUČÁSTÍ KITU

• SALSA MLPA směs sond a odpovídající popis produktu
• Ultrapure voda
• TE0.1 (10 mM Tris-HCl, pH 8,2 + 0,1 mM EDTA)
• Termocykler s vyhřívaným víkem (99 - 105 °C) a standardní laboratorní vybavení
• PCR zkumavky, stripy nebo destičky
• Vysoce kvalitní formamid (například Hi-Di Formamide, Applied Biosystems 4311320)
• Přístroj pro kapilární elektroforézu (Beckman Coulter nebo Applied Biosystems)
• Značené velikostní standardy
  • Beckman: CEQ™ DNA Size Standard Kit - 600 (p / n 608095)
  • Applied Biosystems: GeneScan™ 500 LIZ^® (4322682) nebo 500 ROX™ (4310361)
• Polymery
  • Beckman: GenomeLab ™ Linear Polyacrylamide (LPA) denaturační gel (p/n 391438)
  • Applied Biosystems: doporučujeme POP-4 (4352755) nebo POP-7 (4352759). POP-6 se nedoporučuje, protože má vysoké rozlišení, pro některé starší sekvenátory však může být POP-6 jediná možnost.
• Analytický software Coffalyser.Net a uživatelská příručka a pokyny pro analýzu specifického produktu

3.5. BEZPEČNOSTNÍ OPATŘENÍ A UPOZORNĚNÍ

• Pro použití pouze in vitro.
• Vždy se důkladně seznamte s nejnovější verzí popisu příslušného kitu a s MLPA obecným protokolem. Striktně dodržujte tento protokol.
• Pouze pro profesionální použití. Výkon testu je závislý na znalosti obsluhy a dodržování procesních pravidel. Test by měl být proveden odborníky vyškolenými v molekulárních technikách.
• Osoba odpovědná za interpretaci výsledků by měla být informována o nejnovějších vědeckých poznatcích o dané aplikaci a být si vědoma limitací metody MLPA, které mohou vést k nesprávným výsledkům.
• Abnormality zjištěné pomocí MLPA by měly být vždy potvrzeny nezávislou metodou, kdykoli je to možné, a to zejména v případě, když se týkají jediné sondy MLPA.
• Interní validace každé MLPA aplikace je nezbytná; měla by obsahovat alespoň 16 normálních vzorků DNA. Validace by měla vykazovat směrodatnou odchylku <0,10 pro každou sondu (pokud v Popisu produktu není uvedeno jinak).

3.6. LIMITACE METODY

• U většiny aplikací MLPA jsou hlavní příčinou většiny genetických defektů malé (bodové) mutace, z nichž většina nebude detekována MLPA sondami. MLPA nebude detekovat většinu inverzí, balancovaných translokací, ani změny v počtu kopií, které leží mimo (nebo jen částečně uvnitř) sekvence, které jsou detekované MLPA sondami.
• Falešně pozitivní nebo negativní výsledky mohou být způsobeny různými faktory, k nimž patří:

1. Nečistoty v testovaných vzorcích nebo referenční DNA, včetně NaCl a KCl (> 40 mM) a dalších solí, fenolu, ethanolu, heparinu, EDTA (> 1,5 mmol) a Fe. Koncentrace nečistot se zvýší v důsledku odpaření vzorku DNA nebo při koncentraci vzorku DNA pomocí SpeedVac - nepoužívejte tyto způsoby koncentrace vzorku!
2. Použití nekvalitního plastu, u něhož může dojít k úniku nečistot, jako je uvolnění látek do MLPA reakce.
3. Depurinace vzorku DNA v průběhu počáteční 98 °C denaturace. Tato situace může nastat, když má vzorek nedostatek pufrační kapacity (vzorek rozpuštěný v dH2O místo TE). Ve vzorku DNA je zapotřebí minimálně 5 mM Tris pH 8,2.
4. Problémy při denaturaci DNA mohou způsobit, že templátová DNA (její část) nebude přístupná pro MLPA sondy. Některé metody purifikace DNA, například Qiagen EZ1, mohou vést k vysoké koncentraci soli v DNA vzorku. Extrémně GC-bohaté oblasti nejsou denaturovány při 98 °C, když je přítomen více než 40 mM chlorid sodný nebo chlorid draselný.
5. Použití DNA z celogenomové amplifikace (WGA), která zkresluje amplifikaci.
6. Použití nesprávného množství DNA.
7. Použití nedostatečných nebo nevyhovujících referenčních vzorků.
8. Nesprávné míchání roztoků enzymů (například míchání nedostatečné nebo příliš silné).
9. Odlišné poměry sondy, které jsou způsobené (neškodnými) SNP mutacemi a malými indels v cílové sekvenci sondy.
10. Odpařování při hybridizaci, které způsobuje zvýšení koncentrace solí a silnou sekundární strukturu DNA. To může bránit navázání sondy k cílové sekvenci.
11. Kontaminace během reakce MLPA nebo elektroforéza s jinými produkty PCR.
12. Problémy při kapilární elektroforéze, včetně saturace zařízení, která způsobuje, že píky jsou off-scale (mimo měřítko).
13. Problémy během normalizace, včetně použití nesprávných algoritmů normalizace nebo softwaru.
14. Nesprávná interpretace výsledků z důvodu nedostatečné znalosti aplikace nebo testovaného genu (ů).
15. Nedostatečná znalost klinického účinku nalezené genetické aberace. Ne všechny delece a duplikace detekováné pomocí MLPA musí být patogenní.

4. NÁVOD PRO PROVEDENÍ TESTU

4.1. PŘÍPRAVA VZORKU

1. Použijte celkové množství 50 až 250 ng (nejlépe 50 až 100 ng) lidské DNA v objemu 5 ul pro každou reakci MLPA. Pokud je to nutné, mohou být vzorky DNA koncentrovány srážením ethanolem. Glykogen (Roche 901393) může být použit jako nosič při srážení ethanolem. Více informací naleznete na mlpa.com.
2. Rozpusťte vzorek DNA v TE0.1 (10 mM Tris-HCl pH 8,2 + 0,1 mM EDTA). DNA vzorky by měly obsahovat 5 až 10 mM Tris pufru s pH 8,0 až 8,5, aby se zabránilo depurinaci během počáteční denaturace při 98 °C. Pokud je vám známo, že je přítomno nedostatečné množství pufru, přidejte Tris-HCl: 4μl vzorek DNA + 1 ul 50 mM Tris-HCl pH 8,5.
3. V případě pochybností o kvalitě DNA: a) použijte pouze 50 ng vzorku DNA; b) přečistěte kontaminované vzorky pomocí srážení ethanolem nebo kitem založeným na oxidu křemičitém; c) použijte alternativní dvou-zkumavkový PCR protokol, který používá pouze část ligační reakce pro PCR (viz bod 5.1).
4. MLPA je citlivější na znečišťující látky než jednoduché monoplexní PCR. Znečišťující látky z DNA extrakce (uvedené v 3.6) mohou ovlivnit výkon MLPA. Chcete-li minimalizovat jejich vliv, ujistěte se, že metoda extrakce, typ tkáně, koncentrace DNA a příprava jsou stejné u testovaných i referenčních vzorků.
5. Koncentrace EDTA ve vzorcích nesmí být vyšší než 1,5 mM. Vzorek DNA by neměl být koncentrován odpařením nebo SpeedVac, neboť to vede k velmi vysoké koncentraci EDTA.
6. Heparinizovaná krev není vhodná pro extrakci DNA. Je obtížné odstranit heparin z DNA vzorků a může narušit reakci MLPA PCR. Některé metody purifikace DNA (například NucleoSpin gDNA Clean-up XS) jsou schopny odstranit kontaminaci heparinem.
7. Nepoužívejte Qiagen M6, M48 a M96 systémy pro izolaci DNA (vysoká koncentrace solí). Pro Qiagen EZ1, používejte pouze QIAGEN dodatkový protokol pro použití Third Wave Invader^® testů (viz mlpa.com).
8. DNA z celogenomové amplifikační reakce (WGA) není vhodná pro MLPA, protože její amplifikace je zkreslená.
9. Firma MRC-Holland testovala a doporučuje vám následující metody extrakce:

• Qiagen Autopure LS (automatizovaný) a QIAamp DNA mini/midi/maxi kit (manuální)
• Promega DNA extraction Wizard (manuální)
• Vysolování (manuální)

4.2. VÝBĚR REFERENČNÍCH A DALŠÍCH KONTROLNÍCH VZORKŮ

1. Referenční vzorky. Referenční vzorky by měly být zahrnuty v každém MLPA experimentu. Drobné rozdíly v experimentálním provedení mohou mít vliv na MLPA profil píků. Porovnávejte pouze vzorky, které jsou a) součástí stejného MLPA experimentu, b) testujete je stejnou šarží kitu.
2. Více referenčních vzorků je potřeba pro odhad reprodukovatelnosti každé sondy v rámci každého běhu MLPA. Minimální počet jsou 3 různé referenční vzorky. Při testování > 21 vzorků: přidejte jeden referenční vzorek na 7 dalších testovaných vzorků. Referenční vzorky by měly být rozděleny náhodně na destičce, aby se minimalizovala variabilita.
3. Výběr referenčních vzorků. Referenční vzorky jsou vzorky DNA, u nichž se očekává, že jejich sekvence mají normální počet kopií a jsou získané od zdravých jedinců / tkání. Referenční vzorky by měly být co možná nejpodobnější testovaným vzorků ve všech ostatních aspektech (viz 4.1). U tkání fixovaných formalínem a zalitých v parafinu by měly být referenční vzorky získané z podobně upravených zdravých tkání.
4. Komerční DNA. V případě pochybností o kvalitě vzorku, zahrňte do testu jeden nebo více komerčních vzorků DNA pro porovnání (doporučujeme: Promega Cat Nr G1471 DNA muž, G1521 DNA žena).
5. Kontrola bez DNA. Každý běh MLPA musí zahrnovat kontrolní vzorek bez DNA: nahraďte 5 ul DNA pufrem TE (10 mM Tris-HCl pH 8,2 + 0,1 mM EDTA) pro kontrolu kontaminace TE, MLPA činidly nebo činidly z elektroforézy a kapilár.
6. Pozitivní kontrolní vzorky. Zahrnutí pozitivních kontrol do testu se doporučuje, pokud je to možné. Při použití DNA z buněčné linie mějte na vědomí, že může obsahovat další změny v počtu kopií, vč. kompletních chromozomálních zisků / ztrát.
7. Alikvotujte přesně/pečlivě referenční/kontrolní vzorky a uchovávejte je při -20 °C. Kontaminace mikroorganismy nebo plísněmi může zhoršit kvalitu vzorků, které se skladují delší dobu při teplotě 4 °C.

5. MLPA reakce - DNA detekce / kvantifikace

5.1. Poznámky – čtěte před provedením (1. den)

• Použijte kalibrovaný termocykler s vyhřívaným víkem (99 - 105 °C).
• Vždy vortexujte rozmražené pufry a sondy před použitím. MLPA pufr je obvykle ve zmrazeném stavu při teplotě -20 °C, ale může zůstat kapalný vzhledem k jeho vysoké koncentraci solí.
• Centrifugujte všechny MLPA zkumavky několik sekund před použitím, neboť kapky roztoků mohou zůstávat na víčku.
• Enzymové roztoky obsahují 50% glycerol a zůstávají tekuté při doporučené teplotě skladování. Nikdy nevortexujte enzymové roztoky. Master mixy, které obsahují enzymy, by měly být míchány jemně pipetováním nahoru a dolů. Pokud viskózní roztok enzymu není správně smíchán s pufrem, získáte nespolehlivé výsledky! Pokud se roztok enzymu míchá příliš intenzivně, dochází k inaktivaci enzymu. Při přípravě master mixů vždy přidávejte enzymy poslední.
• Chcete-li minimalizovat variabilitu mezi vzorky, připravte si dostatečně velký objem master mixu. Přidejte 5 - 10 % objemu, aby bylo možné eliminovat chyby pipetování. Připravte Ligase-65 Master Mix a Polymerase Master Mix < 1 hodinu před použitím a uložte na led.
• Při testování velkého počtu vzorků použijte vícekanálovou pipetu, aby se zabránilo nadměrnému odpařování.
• V tomto obecném protokolu MLPA se používá celý objem (40ul) ligační reakce pro PCR. Alternativní dvou-zkumavkový protokol MLPA, který používá pouze 10 ul ligační reakce pro PCR, je k dispozici na mlpa.com.
  Dvou-zkumavkový protokol může být výhodný při použití vzorků DNA, které obsahují nečistoty, jako je vysoká koncentrace EDTA (> 1,5 mM) nebo PCR inhibitory. Lahvička PCR pufru nutného pro tento alternativní protokol může být objednána zdarma. Dvou-zkumavkový protokol je pouze pro výzkumné účely (RUO), nikoliv pro diagnostické použití in vitro (IVD).

5.2. Program termocykleru pro MLPA reakci

5.3. Denaturace DNA (1. den)

• Označte 0,2 ml zkumavky, stripy nebo destičky.
• Přidejte 5 ul vzorku DNA (50 až 250 ng, 50 až 100 ng, je optimální) do každé zkumavky. Použijte TE pro " kontrolu bez DNA".
• Umístěte PCR mikrozkumavky do termocykleru; spustěte na termocykleru MLPA program (viz výše). Denaturujte vzorek DNA 5 minut při 98 °C; zchladtě vzorky až na 25 °C před vyjmutím zkumavek z termocykleru.

5.4. Hybridizace (1. den

• Vortexujte MLPA pufr a MLPA sondy před použitím.
• Přípravte hybridizační master mix, který obsahuje na každou reakci: 1,5 ul MLPA pufru (žluté víčko) + 1,5 ul sond (černé víčko). Promíchejte dobře hybridizační master mix pipetováním nebo třepáním.
• Po denaturaci DNA přidejte 3 ul hybridizačního master mix do každé zkumavky. Dobře promíchejte pipetováním nahoru a dolů.
• Pokračujte v programu v termocykleru: inkubace po dobu 1 min při 95 °C, pak 16 - 20 hodin při teplotě 60 °C.

5.5. Ligace (2. den)

• Vortexujte oba (dva) ligázové pufry před použitím.
• Připravte si Ligase-65 master mix. Pro každou reakci smíchejte: 25 ul dH2O + 3 ul Ligase Buffer A (průhledné víčko) + 3 ul Ligase Buffer B (bílé víčko). Pak přidejte 1 ul Ligase-65 enzymu (zelené víčko). Dobře promíchejte jemným pipetováním nahoru a dolů. Nikdy roztoky enzymů nevortexujte.
• Pokračujte v programu v termocykleru: pauza při 54 °C.
• Když jsou vzorky při 54 °C, přidejte 32 ul ligázového master mix do každé zkumavky. Promíchejte jemně pipetováním nahoru a dolů. Přidejte ligázový master mix, zatímco jsou vzorky v termocykleru!
• Pokračujte v programu v termocykleru: 15 min inkubace při 54 °C (pro ligaci); 5 min při 98 °C pro tepelnou inaktivaci enzymu Ligáza-65. Pauza při teplotě 20 °C. V tomto okamžiku mohou být zkumavky vyjmuty z termocykleru.

5.6. PCR REAKCE (2. DEN)

• Vortexujte SALSA PCR primery. Ohřejte polymerázu po dobu 10 sekund v ruce kvůli snížení viskozity.
• Připravte polymerázový master mix. Pro každou reakci smíchejte: 7,5 ul dH₂O + 2 ul SALSA PCR směsi primerů (hnědé víčko) + 0,5 ul SALSA Polymerase (oranžové víčko). Dobře promíchejte pipetováním nahoru a dolů; nevortexujte. Skladujte na ledě až do použití.
• Při pokojové teplotě, přidejte 10 ul polymerázového master mixu do každé zkumavky. Promíchejte jemně pipetováním nahoru a dolů. Vložte zkumavku do termocykleru a pokračujte v programu; 35 cyklů 30 sekund 95 °C; 30 sekund 60 °C; 60 sekund 72 °C. Závěrečná 20 min inkubace při 72 °C; pauza při teplotě 15 °C.
• Po skončení PCR reakce, neotvírejte zkumavky v místnosti s termocyklerem, aby se zabránilo kontaminaci, použijte jiné mikropipety pro míchání MLPA reakce a manipulaci s produkty MLPA PCR.
• PCR produkty mohou být skladovány při teplotě 4 °C po dobu 1 týdne. Delší dobu skladujte produkty mezi -25 ° C / -15 °C. Jelikož fluorescenční barvy jsou citlivé na světlo, skladujte PCR produkty v tmavé krabičce nebo zabalené do hliníkové fólie.

6. SEPARACE FRAGMENTŮ POMOCÍ KAPILÁRNÍ ELEKTOFORÉZY

6.1. POZNÁMKY - ČTĚTE PŘED PROVEDENÍM

• Velikost standardů, podmínky běhu, polymer, fluorescenční barvivo a objem reakce MLPA PCR závisí na typu přístroje. Níže uvedená nastavení jsou standardní nastavení. Nastavení přístroje může vyžadovat optimalizaci pro optimální separaci fragmentů MLPA; říďte se pokyny výrobce kapilární elektroforézy.
• Použití staré kapiláry nebo polymeru má nepříznivý vliv na výsledky MLPA. Vyměňujte kapiláry a polymer pravidelně. Kvalita polymeru se rychle zhoršuje po delší době při teplotě > 25 ° C. Pokud jsou píky velikostních standardů nízké a široké, pak se obvykle zhoršila kvalita kapilár nebo polymeru.
• Formamid může být kyselý. Používejte kvalitní formamid a skladujte ho při -20 °C.
• V případě že jsou všechny MLPA píky nízké, nepřidávejte další MLPA PCR produkt do vstřikované směsi! Přidáním více PCR produktu se zvyšuje koncentrace soli v injekční směsi, která konkuruje s DNA pro injekci. Pokud chcete zvýšit výšku píků, zvyšte čas vstřikování/napětí. Žádný pík by neměl být mimo měřítko!
• Obnovte nastavení programu pro fragmentační analýzu, kdykoli používáte jinou a) šarži kitu MLPA; b) velikostní standardy; c) zařízení pro kapilární elektroforézu nebo d) nastavení pro běh.

6.2. SPECIFIKACE ELEKTROFORÉZY

* ABI-3130, 3500, 3730 byly validovány a shledány jako vhodné pro použití IVD-registrovaných MLPA produktů.

‡ Krátké ohřátí injekční směsi před kapilární elektroforézou je nutné.

7. KONTROLA MLPA A ŘEŠENÍ PROBLÉMŮ S KVALITOU

Pro analýzu MLPA dat použijte Coffalyser.Net software, který je volně ke stažení z mlpa.com. Coffalyser.Net software poskytuje kvalitní výsledky pro každou reakci a pomáhá při interpretaci kontrolních fragmentů, které jsou zahrnuty v každém kitu SALSA MLPA.

7.1. KONTROLA KVALITY MLPA FRAGMENTŮ

Téměř všechny směsi sond (kity) SALSA MLPA obsahují devět referenčních fragmentů, jak je popsáno níže:

¹Jsou známy vzácné případy, kdy muži nemají Y specifickou sekvenci a ženy mají tuto Y sekvenci na X chromozómu.

Kvantitativní kontrolní fragmenty (Q-fragmenty)
Čtyři kvantitativní fragmenty (Q-fragmenty, v délce 64-70-76-82 nt) jsou kompletní fragmenty, které nepotřebují hybridizaci nebo ligaci, aby byly amplifikovány při PCR. Čím více DNA se přidá, tím nižší jsou Q-fragmenty; viz Obrázek 3.
Všechny čtyři Q-fragmenty jsou vysoké: nedostatečné množství použité DNA nebo neproběhla ligace!

Denaturační kontrolní fragmenty (D-fragmenty)
Dva DNA denaturační fragmenty (D-fragmenty, 88 a 96 nt) detekují sekvence v mimořádně silných CpG ostrovech. CpG ostrovy mají vysoký obsah GC a je obtížné je denaturovat. Pokud jsou 88 * a 96 nt fragmenty nízké (< než 40% z 92 nt kontrolního fragmentu), poukazuje to na problémy při denaturaci vzorku DNA. Špatná denaturace může být v důsledku přítomnosti > 40 mM soli ve vzorku DNA. Neúplná denaturace DNA může vést k falešně pozitivní deleci!
* POZNÁMKA: Při použití ABI POP7 polymeru nespecifický fragment ~ 87 nt je obvykle přítomný a může se shodovat s 88 ​​nt D-fragmentem!

Nízké D-fragmenty: neúplná denaturace DNA!

7.2. KONTROLA BEZ DNA

U typické kontroly bez DNA jsou viditelné čtyři Q-fragmenty. Nicméně, MLPA PCR reakce je více náchylná k nespecifickým píkům u kontroly bez DNA než běžná PCR. U některých směsí sond může být několik píků u kontroly bez DNA. Tyto nespecifické píky by neměly ovlivňovat výsledky MLPA: když se používá dostatečné množství vzorku DNA, tyto píky by měly být potlačeny MLPA sondami, podobně jako Q - fragmenty na Obrázku 3. Informujte MRC-Holland v případě, že nespecifické píky v kontrole bez DNA jsou opakovatelně vyšší než u Q-fragmentů.

7.3. PROBLÉMY S ODPAŘOVÁNÍM

Odpařování se může objevit (A) při pipetování ligační reakce při 54 °C, nebo (B) při hybridizaci přes noc. V případě podezření na problémy s odpařováním, vám mohou pomoci následující opatření:

(A): Snižte čas manipulace použitím vícekanálové pipety.
(B): Otestujte odpařovaní inkubací 8 ul H2O přes noc při 60 °C; > 5 ul H2O by mělo zůstat. Chcete-li snížit odpařování: 1. Oveřte, že vyhřívané víko funguje dobře; 2. Optimalizujte zvýšení / snížení tlaku víka na zkumavky; 3. Vyzkoušet různé zkumavky (například Thermo Fischer ABgene AB-0773, AB-0451); 4. Použijte minerální olej (Vapor-lock, Qiagen 981611): přidejte kapku oleje na DNA vzorek, jen tolik, aby byl pokrýt. Odstraňovat olej není potřeba. Po přidání pufru a MLPA sond nebo polymerázového mixu: centrifugujte velmi krátce. Po přidání ligázové směsi: míchejte jemně pipetováním nahoru a dolů.

7.4. ŘEŠENÍ PROBLÉMŮ

Podrobný diagram/postup Kontroly kvality je k dispozici na mlpa.com a může být použit pro kontrolu kvality a řešení problémů.

8. PRINCIP ANALÝZY MLPA DAT<

8.1. COFFALYSER.NET PRO ANALÝZU MLPA DAT

Použijte software Coffalyser.Net pro analýzu MLPA dat. Manuál Coffalyser.Net poskytuje krok za krokem instrukce, jak provádět analýzu MLPA dat. Software i manuál jsou volně ke stažení na mlpa.com. Tato část popisuje základní principy MLPA analýzy. Coffalyser.Net analýza je založena na těchto zásadách, ale používá robustnější algoritmus. Kromě toho, Coffalyser.Net vybere nejvhodnější metody analýzy pro každý MLPA kit a nabízí rozsáhlou kontrolu kvality ².

8.2. ZÁSADY NORMALIZACE  MLPA DAT  I: Od píků ke kvocientu dávky (DQ)

Absolutní fluorescenci měřenou pomocí kapilární elektroforézy nelze použít přímo pro výpočet počtu kopií, neboť je ovlivněna mnoha proměnnými. Za prvé, fluorescence každé sondy musí být normalizována v každém vzorku, abyste získali smysluplné výsledky. Za druhé, je třeba provést porovnání různých vzorků, abyste zjistili, který vzorek má abnormální počet kopií. Z tohoto důvodu se MLPA normalizace skládá z 2 kroků: intra-vzorková normalizace (porovnání píků sond v rámci vzorku) a mezi-vzorková normalizace (porovnání relativních píků sond mezi vzorky.)

1. Normalizace v rámci vzorku. V každém vzorku se porovnávají píky jednotlivých sond s píky referenčních sond. Referenční sondy detekují sekvence, u kterých se očekává, že mají normální počet kopií ve všech vzorcích. Téměř všechny kity MLPA obsahují 8 nebo více referenčních sond umístěných na různých chromozómech.
   Relativní signály sond detekované v kroku 1 se pak používají v:
2. Normalizace mezi vzorky. Finální poměry sond jsou určeny porovnáním relativních píků sond v testovaném vzorku DNA s píky sond všech referenčních vzorků. Předpokládá se, že referenční vzorky budou mít normální počet kopií pro referenční i cílové sondy.
   Profil píků testovaného vzorku DNA bez genomových abnormalit bude totožný s profilem referenčních vzorků: finální poměry sond stanovené v kroku 2 budou ~ 1,0. U heterozygotní delece budou poměry sond ~ 0,5. Tyto finální poměry sond se také nazývají Kvocient dávky (Dosage Quotient - DQ). Coffalyser.Net vypočítá DQ pro každou sondu v každém vzorku. Sondy jsou uspořádány podle chromozomální lokalizace pro správnou interpretaci; a to také pomáhá při odhalování drobných změn, jako je mozaika.

8.3. ZÁSADY NORMALIZACE MLPA DAT II:  Od kvocientu dávky k počtu kopií

Jak rozlišit normální výsledky, delece a duplikace? Tabulka 1 uvádí vztahy mezi počtem kopií a typickou distribucí DQ (na základě velkého počtu vzorků testovaných v MRC-Holland).

Kromě toho, standardní odchylka každé sondy by měla být měřena pro zajištění věrohodnosti výsledků³. Coffalyser.Net software považuje výsledek za statisticky významnou změn, pokud:

1. DQ sonda 1 vzorku A > 2 směrodatné odchylky vyšší/nižší než průměr DQ sondy 1, ref. vzorku X, Y, Z Heterozygotní delece, duplikace, může být přítomna, pokud platí následující:
2. DQ sonda 1 vzorek A pod 0,7 nebo nad 1,3 - indikuje heterozygotní deleci/ duplikaci⁴.

9. INTERPRETACE VÝSLEDKŮ

Informace uvedené v popisu produktu pro specifický MLPA kit je zásadní pro správnou interpretaci výsledků MLPA.

Posouzení, zda získané výsledky jsou spolehlivé a interpretace výsledků MLPA správná, vyžaduje dobrou znalost MLPA metody a testované aplikace. Mějte na paměti následující:

• U většiny aplikací jsou hlavní příčinou genetických defektů malé (bodové) mutace, z nichž většina nebude detekována MLPA. MLPA nebude detekovat většinu inverzí, translokací, ani změny v počtu kopií, které leží mimo cílovou sekvenci rozpoznávanou MLPA sondou. MLPA kity nedetekují delece/duplikace ležící mimo cílové sekvence svých sond. MLPA sondy typicky detekují sekvence o délce ~ 55-80 nt. Většina popisů produktů zmiňuje pouze dílčí sekvence sondy. Kompletní sekvence sond jsou k dispozici na mlpa.com.
• Změny (SNP, bodové mutace) v cílové sekvenci DNA sondy (až > 10 nt od vazebného místa) mohou způsobovat falešné delece: tyto změny mohou snížit signál sondy buď blokací vazby sondy nebo destabilizací vazby mezi sondou a cílovou DNA₆.
• Změny v počtu kopií detekované jedinou sondou vždy vyžadují potvrzení. Sekvenování cílové sekvence sondy může ukázat, zda snížený signál sondy je způsoben mutací/polymorfismem. Nález dvou heterozygotních sekvencí obvykle znamená, že vzorek DNA obsahuje dvě různé alely. Naproti tomu, detekce pouze jediné vzácné alely sekvenováním ještě neznamená, že druhá "normální" alela je deletována: nižší signál sondy může být způsoben homozygotním SNP, dokonce i když je SNP velmi vzácný!
• Long-range PCR a qPCR jsou často používány pro potvrzení delece (jednoho) exonu. Můžete si také navrhnout Vaše vlastní syntetické MLPA sondy pro potvrzení výsledků (např Hills A. et al., (2010), Mol Cytogenet. 03:19). Informace o designu MLPA sond jsou dostupné na mlpa.com (pouze pro výzkumné účely).
• Ne všechny delece a duplikace zjištěné MLPA jsou patogenní. MRC-Holland nemůže poskytnout informace, zda delece nebo duplikace specifického exonu bude mít za následek onemocnění. U mnoho genů jsou popsány exony, které jsou přítomny pouze v některých transkripčních variantách. U některých genů, jako je DMD, delece ve čtecím rámci vedou k mírnému nebo žádnému onemocnění₇. Duplikace jednoho nebo více exonů může však porušit kopii tohoto genu, což vede k onemocnění, zatímco kompletní genová duplikace nemusí být patogenní. Všimněte si, že duplikace zahrnující první nebo poslední exon genu může ponechat jednu funkční intaktní kopii.
• Zárodečné změny v počtu kopií u zdravých jedinců lze nalézt na projects.tcag.ca/variation/. Určité odchylky v počtu kopií mohou být způsobeny somatickými změnami. Například, somatická trizomie 12 je časnou známkou chronické lymfocytární leukémie (CLL).
• Špatná denaturace vzorku DNA může vést ke zdánlivé deleci několika sond vedle sebe a jde tak o falešně pozitivní výsledek! Přítomnost solí ve vzorcích DNA (například> 40 mM NaCl) zabraňuje DNA denaturaci GC-bohatých oblastí. Sekvence v blízkosti těchto CpG ostrovů může denaturovat při 98 ^oC, ale bude se okamžitě spojovat po ochlazení, neboť nedenaturovaný CpG ostrov drží tyto dva řetězce dohromady. Vazba sondy na cílovou sekvenci v těchto regionech bude narušena, což vede ke snížení signálu u sond umístěných v oblasti několika kb od těchto silných CpG ostrovů. D-fragmenty vždy zkoumejte pozorně!
• MLPA testy poskytují průměrný počet kopií cílové sekvence v buňkách, ze kterých se vzorek DNA izoloval. V případě, že některé sondy pro přilehlé sekvence mají neobvyklou hodnotu, ale nedosahují obvyklé prahové hodnoty pro deleci/duplikaci, může být přítomna mozaika (0,65
• Většina MLPA kitů obsahuje referenční sondy. Změny v počtu kopií detekované referenčními sondami pravděpodobně nesouvisí s testovaným onemocněním nebo stavem. Totožnost referenčních sond je k dispozici na vyžádání.
• V některých případech pro správnou interpretaci výsledků může být nezbytná analýza rodičovských vzorků.
• Interní validace MLPA ve Vaší laboratoři je nezbytná.

Výsledky MLPA jsou spolehlivější, pokud:

• Celková směrodatná odchylka každé sondy v referenčních vzorcích je nízká (<10%).
• Sondy vykazují snížený nebo zvýšený signál u sousedních exonů (delece několika exonů nebo duplikace).
• Stejný výsledek se získá v nové MLPA, při které se použije méně DNA (pokud je to možné) nebo pomocí různých referenčních vzorků. Použije-li se méně DNA, veškeré případné nečistoty, které mohou mít vliv na signál sond, se naředí.

Výsledky MLPA budou pravděpodobně nespolehlivé pokud:

• Sondy pro nesousední exony vykazují snížený nebo zvýšený signál, například delece exonu 3 a 17.
• Ve stejném vzorku jedna nebo více referenčních sond vykazuje abnormální počet kopií.
• Změny v počtu kopií jsou detekovány s neobvykle vysokou frekvencí v souboru pacientů s určitým onemocněním.

10. STRUČNÝ MLPA PROTOKOL

1. DNA denaturace

• Zahřejte 5 ul vzorku DNA po dobu 5 minut při 98 °C

2. Hybridizace sondy ke vzorku DNA

• Zchlaďte na pokojovou teplotu, otevřete zkumavku
• Přidejte směs 1,5 ul SALSA směs sond a 1,5 ul pufru MLPA a promíchejte
• Inkubujte 1 minutu při 95 °C + hybridizace 16 hodin při 60 °C

3. Ligace  hybridizovaných sond

• Snižte teplotu termocykleru na 54 °C, otevřete zkumavku
• Přidejte 32 ul ligázového master mixu, inkubujte 15 minut při 54 °C
• Zvyšte teplotu pro inaktivaci enzymu ligázy: 5 minut 98 °C

4. PCR amplifikace ligovaných sond

• Zchlaďte na pokojovou teplotu, otevřete zkumavku
• Přidejte 10 ul polymerázového master mixu při pokojové teplotě
• Spusťte PCR

5. Kapilární elektroforéza PCR produktů
6. Analýza výsledků

• Určete relativní velikost fluorescenčních píků v každém vzorku
• Porovnejte tyto výsledky s referenčními vzorky

Ligázový master mix: 3 ul Ligase Buffer A + 3 ul Ligase Buffer B + 25 ul vody + 1 ul Ligase-65. Polymerázový master mix: 7,5 ul vody + 2 ul PCR primerů + 0,5 ul SALSA Polymerase
Poradce při potížích: podrobný postup pro kontrolu kvality je k dispozici na mlpa.com.

₂ Coffalyser.Net začíná analýzu ze syrových dat (korekce základny/baseline, identifikace píků) a provádí rozsáhlou kontrolu kvality (například použité množství DNA; kompletní DNA denaturace, stupeň šikmosti). Korekce sklonu píků je jednou z mnoha možností.

₃ Standardní odchylka se liší u každé sondy a závisí na mnoha faktorech, včetně 1. kvality vzorků DNA (čistota; fragmentace DNA, depurinace, další úpravy); 2. množství použitého vzorku DNA; 3. počet a kvalita referenčních a pozitivních vzorků; 4. experimentální podmínky (například přesnost pipetování, rovnoměrnost teploty v termocykleru, kvalita separace a detekce amplikonů); 5. metoda použitá pro analýzu dat. Coffalyser.Net vyhodnocuje všechny tyto faktory.

₄ Coffalyser.Net používá hodnoty 0,7 a 1,3 jako cut-off hodnoty pro heterozygotní delece nebo duplikace (při normálním diploidním stavu). Coffalyser.Net tak používá ostré cut-off hodnoty, zatímco Tabulka 1 udává podstatně nejednoznačný rozsah DQ pro mozaiky a nádorové vzorky, 0,7 / 1,3 cut-off hranice nejsou použitelné, neboť DQ může mít jakoukoliv hodnotu: výpočet DQ bude záviset na a) velikosti změny počtu kopií a b) procentu různých typů buněk v DNA vzorku. Jelikož Coffalyser.Net určuje významné změny signálu sond vyhodnocením velikosti vypočteného DQ v kombinaci s jeho statistickou významností v experimentu, proto částečná změna počtu kopií může být ještě rozpoznána, pokud a) experiment byl proveden stejně, a b) podobný DQ byl získán u sousedních sond.

₅ Příklad: Ve vzorku A - 30% jeho buněk obsahuje 3 kopie chromozómu 21, 70% obsahuje 2 kopie. DQ nalezený pro sondy Chr. 21 bude: (30% x 3) + (70% x 2) / 2 * = 1,15 (2 *: počet kopií přítomných v referenčních vzorcích)

₆ Při navrhování sond známé SNP jsou eliminovány, pokud je to možné. Nicméně, nové SNP jsou neustále objevovány. Prosím, dejte nám vědet, pokud polymorfismus nebo časté patogenní mutace ovlivňují signál sondy.

₇ Schwartz M. a Duno M. (2004). Improved molecular diagnosis of dystrophin gene mutations using the multiplex ligationdependent probe amplification method. Genet Test. 8:361-7.