Roche 454 FLX Systém pracuje na principu tzv. pyrosekvenování. To lze zjednodušeně popsat jako sled enzymatických reakcí, během kterých se začleňují jednotlivé báze do nově vznikajícího řetězce DNA, přičemž dochází k emisi viditelného světla.
Množství uvolněného světla je úměrné počtu začleněných nukleotidů. Jako všechny platformy má technologie 454 své výhody a nevýhody. Její největší limitací jsou problémy v detekci homopolymerních úseků, jako např. AAA a GGG. Ve srovnání s ostatními platformami však 454 technologie poskytuje velmi dlouhá čtení, a výborně se tak hodí pro celogenomové de novo sekvenování a resekvenování.